Метод сравнения с эталоном –самый простой метод, осуществляется путем последовательного сканирования файлов в поиске масок известных вирусов (некоторая постоянная последовательность кода, специфичная для этого конкретного вируса). Данный метод не эффективен для новых, шифрующихся и полиморфных вирусов.
Эвристический анализ - имея список действий характерных для вирусов (копирование в память, запись в сектора), проверяет программы, загрузочные сектора дисков, пытаясь обнаружить в них вредоносный код. Позволяет обнаруживать не известные ранее вирусы.
Антивирусный мониторинг- осуществляет мониторинг загружаемых и исполняемых программ и документов на выполнение потенциально опасных действий.
Метод обнаружения изменений – запоминая характеристики всех областей диска, которые потенциально могут подвергнуться нападению, периодически проверяет их, сигнализируя об изменениях.
Встраивание антивирусов в BIOS - позволяет контролировать все обращения к главной загрузочной записи жесткого диска.
Обзор антивирусных программ
Фаги (сканеры) – используют метод сравнения с эталоном, эвристического анализатора и др. Сканируют ОП, при нахождении вируса уничтожают его, а затем переходят к «лечению» файлов. Выделяют универсальные сканеры, рассчитанные на поиск и обезвреживание всех типов вирусов вне зависимости от ОС и специализированные – предназначенные для обезвреживания ограниченного числа вирусов и только одного класса (например, макровирусы). По нахождению в ОП делятся на резидентные (сканирование на «лету») и нерезидентные (сканирование по запросу). К достоинства данных программ можно отнести их универсальность, к недостаткам– небольшая скорость поиска вирусов, большие размеры вирусных баз.
Ревизоры (CRC -сканеры) - основаны на подсчете кодов циклического контроля для присутствующих на диске фалов/системных секторов и хранящихся в базе антивирусной программы. При несовпадении данных сканер сигнализирует, о том, что файл заражен или изменен. Однако ревизоры не могут определить вирусы в новых файлах.
Блокировщики – реализуют методантивирусного мониторинга, способность обнаруживать вирус на самой ранней стадии размножения. Недостатком данной программы является не способность уничтожить вирус и «назойливость»- постоянное предупреждение о любой попытке копирования исполняемого файла.
Иммунизаторы- предотвращают заражения файлов. Делятся на 2 класса:
Сообщающие о заражении. Программа записывается в конец файла и при запуске проверяет его на изменение. К недостатку данной программ можно отнести неспособность обнаруживать стелс-вирусы.
Блокирующие заражение каким-либо типом вируса. Происходит модификация файла или диска таким образом, что вирус воспринимает их зараженными и не внедряется. Однако данный иммунизатор защищает систему только от определенных вирусов.
Методы защиты в субд
К защите применительно в аспекте баз данных можно отнести следующие методы:
1. Механизмы аутентификации и идентификации;
2. Механизмы резервного копирования (технология архивации с помощью магнитных лент– достоинства дешево, но долго и зеркальных дисков- быстро но дорого)
3. Механизмы разграничения доступа в зависимости от уровня секретности.
4.Криптографическая защита
Методы и технологии борьбы с компьютерными вирусами
Массовое распространение вирусов, серьезность последствий их воздействия на ресурсы КС вызвали необходимость разработки и использования специальных антивирусных средств и методов их применения. Антивирусные средства применяются для решения следующих задач :
* обнаружение вирусов в КС;
* блокирование работы программ-вирусов;
* устранение последствий воздействия вирусов.
Обнаружение вирусов желательно осуществлять на стадии их внедрения или, по крайней мере, до начала осуществления деструктивных функций вирусов. Не существует антивирусных средств, гарантирующих обнаружение всех возможных вирусов.
При обнаружении вируса необходимо сразу же прекратить работу программы-вируса, чтобы минимизировать ущерб от его воздействия на систему.
Устранение последствий воздействия вирусов ведется в двух направлениях:
* удаление вирусов;
* восстановление (при необходимости) файлов, областей памяти.
Технология восстановления системы зависит от типа вируса, а также от момента времени обнаружения вируса по отношению к началу вредительских действий. Восстановление информации без использования дублирующей информации может быть невыполнимым, если вирусы при внедрении не сохраняют информацию, на место которой они помещаются в память, а также, если деструктивные действия уже начались, и они предусматривают изменения информации.
Для борьбы с вирусами используются программные и аппаратно-программные средства, которые применяются в определенной последовательности и комбинации, образуя методы борьбы с вирусами : методы обнаружения вирусов и методы удаления вирусов.
Известны следующие методы обнаружения вирусов:
1. Сканирование - один из самых простых методов обнаружения вирусов. Сканирование осуществляется программой-сканером , которая просматривает файлы в поисках опознавательной части вируса - сигнатуры . Программа фиксирует наличие уже известных вирусов, за исключением полиморфных вирусов, которые применяют шифрование тела вируса, изменяя при этом каждый раз и сигнатуру. Программы-сканеры могут хранить не сигнатуры известных вирусов, а их контрольные суммы. Программы-сканеры часто могут удалять обнаруженные вирусы. Такие программы называются полифагами .
Метод сканирования применим для обнаружения вирусов, сигнатуры которых уже выделены и являются постоянными. Для эффективного использования метода необходимо регулярное обновление сведений о новых вирусах.
Метод обнаружения изменений базируется на использовании программ-ревизоров . Эти программы определяют и запоминают характеристики всех областей на дисках, в которых обычно размещаются вирусы. При периодическом выполнении программ-ревизоров сравниваются хранящиеся характеристики и характеристики, получаемые при контроле областей дисков. По результатам ревизии программа выдает сведения о предположительном наличии вирусов.
Обычно программы-ревизоры запоминают в специальных файлах образы главной загрузочной записи, загрузочных секторов логических дисков, характеристики всех контролируемых файлов, каталогов и номера дефектных кластеров. Могут контролироваться также объем установленной оперативной памяти, количество подключенных к компьютеру дисков и их параметры.
Главным достоинством метода является возможность обнаружения вирусов всех типов, а также новых неизвестных вирусов. Совершенные программы-ревизоры обнаруживают даже «стелс»-вирусы.
Имеются у этого метода и недостатки . С помощью программ-ревизоров невозможно определить вирус в файлах, которые поступают в систему уже зараженными. Вирусы будут обнаружены только после размножения в системе. Программы-ревизоры непригодны для обнаружения заражения макровирусами, так как документы и таблицы очень часто изменяются.
2. Эвристический анализ сравнительно недавно начал использоваться для обнаружения вирусов. Как и метод обнаружения изменений, данный метод позволяет определять неизвестные вирусы, но не требует предварительного сбора, обработки и хранения информации о файловой системе.
Сущность эвристического анализа заключается в проверке возможных сред обитания вирусов и выявление в них команд (групп команд), характерных для вирусов. Такими командами могут быть команды создания резидентных модулей в оперативной памяти, команды прямого обращения к дискам, минуя ОС. Эвристические анализаторы при обнаружении «подозрительных» команд в файлах или загрузочных секторах выдают сообщение о возможном заражении. После получения таких сообщений необходимо тщательно проверить предположительно зараженные файлы и загрузочные сектора всеми имеющимися антивирусными средствами. Эвристический анализатор имеется, например, в антивирусной программе Doctor Web.
3. Метод использования резидентных сторожей основан на применении программ, которые постоянно находятся в ОП ЭВМ и отслеживают все действия остальных программ.
Технологический процесс их применения осуществляется в следующей последовательности: в случае выполнения какой-либо программой подозрительных действий (обращение для записи в загрузочные сектора, помещение в ОП резидентных модулей, попытки перехвата прерываний и т. п.) резидентный сторож выдает сообщение пользователю. Программа-сторож может загружать на выполнение другие антивирусные программы для проверки «подозрительных» программ, а также для контроля всех поступающих извне файлов (со сменных дисков, по сети).
Существенным недостатком данного метода является значительный процент ложных тревог, что мешает работе пользователя, вызывает раздражение и желание отказаться от использования резидентных сторожей.
4. Под вакцинацией программ понимается создание специального модуля для контроля ее целостности. В качестве характеристики целостности файла обычно используется контрольная сумма. При заражении вакцинированного файла, модуль контроля обнаруживает изменение контрольной суммы и сообщает об этом пользователю. Метод позволяет обнаруживать все вирусы, в том числе и незнакомые, за исключением «стеле»- вирусов.
5. Самым надежным методом защиты от вирусов является использование аппаратно-программных антивирусных средств . В настоящее время для защиты ПЭВМ используются специальные контроллеры и их программное обеспечение. Контроллер устанавливается в разъем расширения и имеет доступ к общей шине. Это позволяет ему контролировать все обращения к дисковой системе.
В программном обеспечении контроллера запоминаются области на дисках, изменение которых в обычных режимах работы не допускается. Таким образом, можно установить защиту на изменение главной загрузочной записи, загрузочных секторов, файлов конфигурации, исполняемых файлов и др.
При выполнении запретных действий любой программой контроллер выдает соответствующее сообщение пользователю и блокирует работу ПЭВМ.
Аппаратно-программные антивирусные средства обладают рядом достоинств перед программными:
* работают постоянно;
* обнаруживают все вирусы, независимо от механизма их действия;
* блокируют неразрешенные действия, являющиеся результатом работы вируса или неквалифицированного пользователя.
Недостаток у этих средств один - зависимость от аппаратных средств ПЭВМ. Изменение последних ведет к необходимости замены контроллера.
Вирусологические методы исследования основаны также на иммунологических процессах (взаимодействие антигена с антителами), биологических свойствах вируса (способность к гемагглютинации, гемолизу, ферментативная активность), особенностях взаимодействия вируса с клеткой-хозяином (характер цитопатического эффекта, образование внутриклеточных включений и т.д.).
В диагностике вирусных инфекций, при культивировании, выделении и идентификации вирусов, а также при получении вакцинных препаратов широко применяют метод культуры клеток. Для выделения вирусов применяют заражение восприимчивых лабораторных животных, куриных эмбрионов, но чаще всего используют культуру ткани. Наличие вируса обычно определяют по специфической дегенерации клеток (цитопатический эффект), образованию симпластов и синцитиев, обнаружению внутриклеточных включений, а также специфического антигена, выявляемого с помощью методов иммунофлюоресценции, гемадсорбции, гемагглютинации (у гемагглютинирующих вирусов) и т.д. Эти признаки могут обнаруживаться лишь после 2-3 пассажей вируса.
Для выделения ряда вирусов, например вирусов гриппа, используют куриные эмбрионы, для выделения некоторых вирусов Коксаки и ряда арбовирусов - новорожденных мышей. Идентификацию выделенных вирусов проводят с помощью серологических реакций и других методов.
При работе с вирусами определяют их титр. Титрование вирусов проводят обычно в культуре клеток, определяя наибольшее разведение вируссодержащей жидкости, при котором происходит дегенерация ткани, образуются включения и вирусоспецифические антигены. Для титрования ряда вирусов можно использовать метод бляшек. Бляшки, или негативные колонии вирусов, представляют собой очаги разрушенных под действием вируса клеток однослойной культуры ткани под агаровым покрытием. Подсчет колоний позволяет провести количественный анализ инфекционной активности вирусов из расчета, что одна инфекционная частица вируса образует одну бляшку. Бляшки выявляют путем окрашивания культуры прижизненными красителями, обычно нейтральным красным; бляшки не адсорбируют краситель и поэтому видны как светлые пятна на фоне окрашенных живых клеток. Титр вируса выражают числом бляшкообразующих единиц в 1 мл.
Очистку и концентрацию вирусов обычно осуществляют путем дифференциального ультрацентрифугирования с последующим центрифугированием в градиентах концентраций или плотности. Для очистки вирусов применяют иммунологические методы, ионно-обменную хроматографию, иммуносорбенты и т.д.
Лабораторная диагностика вирусных инфекций включает обнаружение возбудителя или его компонентов в клиническом материале; выделение вируса из этого материала; серодиагностику. Выбор метода лабораторной диагностики в каждом отдельном случае зависит от характера заболевания, периода болезни и возможностей лаборатории. Современная диагностика вирусных инфекций основана на экспресс-методах, позволяющих получать ответ через несколько часов после взятия клинического материала в ранние сроки после заболевания, К ним относятся электронная и иммунная электронная микроскопия, а также иммунофлюоресценция, метод молекулярной гибридизации, выявление антител класса lgM и др.
Электронная микроскопия вирусов, окрашенных методом негативного контрастирования, позволяет дифференцировать вирусы и определять их концентрацию. Применение электронной микроскопии в диагностике вирусных инфекций ограничивается теми случаями, когда концентрация вирусных частиц в клиническом материале достаточно высокая (105 в 1 мл и выше). Недостатком метода является невозможность отличать вирусы, принадлежащие к одной таксономической группе. Этот недостаток устраняется путем использования иммунной электронной микроскопии. Метод основан на образовании иммунных комплексов при добавлении специфической сыворотки к вирусным частицам, при этом происходит одновременная концентрация вирусных частиц, позволяющая идентифицировать их. Метод применяют также для выявления антител. В целях экспресс-диагностики проводят электронно-микроскопическое исследование экстрактов тканей, фекалий, жидкости из везикул, секретов из носоглотки. Электронную микроскопию широко используют для изучения морфогенеза вируса, ее возможности расширяются при применении меченых антител.
Метод молекулярной гибридизации, основанный на выявлении вирусоспецифических нуклеиновых кислот, позволяет обнаружить единичные копии генов и по степени чувствительности не имеет себе равных. Реакция основана на гибридизации комплементарных нитей ДНК или РНК (зондов) и формировании двунитчатых структур. Наиболее дешевым зондом является клонированная рекомбинантная ДНК. Зонд метят радиоактивными предшественниками (обычно радиоактивным фосфором). Перспективно использование колориметрических реакций. Существует несколько вариантов молекулярной гибридизации: точечная, блот-гибридизация, сэндвич-гибридизация, гибридизация in situ и др.
Серологические методы в вирусологии основаны на классических иммунологических реакциях: реакции связывания комплемента, торможения гемагглютинации, биологической нейтрализации, иммунодиффузии, непрямой гемагглютинации, радиального гемолиза, иммунофлюоресценции, иммуноферментного, радиоиммунного анализа. Разработаны микрометоды многих реакций, техника их непрерывно совершенствуются. Эти методы используют для идентификации вирусов с помощью набора известных сывороток и для серодиагностики с целью определения нарастания антител во второй сыворотке по сравнению с первой (первую сыворотку берут в первые дни после заболевания, вторую - через 2-3 нед.). Диагностическое значение имеет не менее чем четырехкратное нарастание антител во второй сыворотке. Если выявление антител класса lgM свидетельствует о недавно перенесенной инфекции, то антитела класса lgC сохраняются в течение нескольких лет, а иногда и пожизненно. Антитела класса lgM появляются раньше, чем антитела класса G (на 3-5-й день болезни) и исчезают через несколько недель, поэтому их обнаружение свидетельствует о только что перенесенной инфекции. Антитела класса lgM выявляют методом иммунофлюоресценции или с помощью иммуноферментного анализа, используя анти- m-антисыворотки (сыворотки против тяжелых цепей lgM).
Лабораторные методы при диагностике вирусных инфекций включают:
Выделение и идентификацию возбудителя;
Обнаружение и определение титров противовирусных AT;
Обнаружение Аг вирусов в образцах исследуемого материала;
Микроскопическое исследование препаратов исследуемого материала.
Забор материала. При заборе материала для исследований необходимо выполнять следующие условия:
Образцы следует отбирать как можно раньше либо с учётом ритма циркуляции возбудителя;
Материал следует отбирать в объёме, достаточном для всего комплекса исследований;
Образцы следует доставлять в лабораторию незамедлительно, при относительно кратковременной транспортировке (не более 5 сут) образцы сохраняют на льду, при более длительной - при температуре -50 °С.
Выделение и культивирование вирусов
Выделение и идентификация возбудителя - «золотой стандарт» в диагностике вирусных инфекций.
Культуры клеток
Вирусы размножаются только в живых клетках, и выделение возбудителя в заражённой культуре клеток - один из основных методов диагностики вирусных инфекций. Поскольку большинство патогенных вирусов отличает тканевая и типовая специфичность, то почти к каждому вирусу можно подобрать соответствующие клеточные или тканевые культуры, а также создать стандартные условия культивирования (наличие клеток одного типа). Размножение вируса обеспечивают чувствительные (пермиссивные) клетки. Поэтому при выделении неизвестного возбудителя проводят одномоментное заражение 3-4 культур клеток, предполагая, что одна из них может оказаться пермиссивной. Культуры клеток получают диспергированием соответствующих органов и тканей, но чаще используют эмбриональные ткани (человека и животных) либо трансформированные опухолевые клетки. При помещении на соответствующую плоскую поверхность клеточные культуры обычно растут в виде монослоя.
Первично-трипсинизированные культуры. Суспензии клеток получают гомогенизированием соответствующих тканей, предварительно обработанных трипсином. Культуры часто представлены клетками смешанного типа и не подлежат повторному культивированию. Жизнеспособность таких культур составляет 2-3 нед.
Полуперевиваемые линии клеток представлены диплоидными клетками человека и животных. Культуры ограниченно пригодны к повторному диспергированию и росту (как правило, не более 20-30 пересевов), сохраняя при этом жизнеспособность и не подвергаясь спонтанной трансформации.
Перевиваемые линии клеток (гетероплоидные культуры) представлены клетками, подвергнутыми длительному культивированию и спонтанным трансформациям. Культуры способны к многократному диспергированию и перевиванию. Работа с ними менее трудоёмка по сравнению с приготовлениями первичных культур; перевиваемые клетки относительно одинаковы по своей морфологии и стабильны по свойствам.
Культуры органов
Не все виды клеток способны расти в виде монослоя, в некоторых случаях поддержание дифференцированных клеток возможно только в культуре органа. Обычно это суспензия ткани, обладающей специализированной функцией, также обозначаемая как культура переживающей ткани.
Куриные эмбрионы
Куриные эмбрионы - практически идеальные модели для культивирования некоторых вирусов (например, гриппа и кори). Замкнутая полость эмбриона препятствует проникновению микроорганизмов извне, а также развитию спонтанных вирусных инфекций. Эмбрионы применяют для первичного выделения вирусов из патологического материала; для пассирования и сохранения их, а также для получения необходимых количеств вируса. Некоторые возбудители (например, герпесвирусы) вызывают характерные изменения (по ним можно распознавать заболевание). Заражение проводят на хорион-аллантоисную оболочку, в амниотическую или аллантоисную полость либо в желточный мешок.
Заражение на хорион-аллантоисную мембрану. Обычно используют 10-12-суточные эмбрионы. Яйца просматривают в проходящем свете, отмечают локализацию воздушного мешка и выбирают область без сосудов. Осторожно удаляют фрагмент скорлупы, освобождают наружную оболочку и отслаивают её осторожным надавливанием. Затем делают отверстие у края воздушного мешка. При отсосе через это отверстие хорион-аллантоисная оболочка отслаивается от наружной оболочки. На неё наносят исследуемый материал, свободный от бактерий и простейших (пропущенный через бактериальные фильтры и обработанный бактерицидами).
Заражение в амниотическую полость. Обычно используют 7-14-суточные эмбрионы, у которых после отслоения хорион-аллантоисной оболочки (см. выше) расширяют отверстие, захватывают пинцетом амниотическую оболочку и выводят через хорион-аллантоисную оболочку. Через неё в амниотическую полость вводят исследуемый материал.
Заражение в аллантоисную по лость. 10-суточные эмбрионы заражают через отверстия, сделанные в скорлупе и подлежащих оболочках (см. выше).
Заражение в желточный мешок. Используют 3~8-суточные эмбрионы, у которых в этом возрасте желточный мешок занимает почти всю полость яйца. Заражение проводят через отверстие, сделанное в воздушном мешке
Наблюдение и учёт результатов. В качестве вируссодержащего материала можно использовать содержимое желточного мешка, аллантоисную и амниотическую жидкости либо весь эмбрион, нарезанный вместе с окружающими тканями на кусочки. Для выявления характерных поражений на хорион- развивающегося куриного эмбриона.
аллантоисной мембране удаляют скорлупу и наружную оболочку. Затем мембрану извлекают и помещают в стерильную воду. Характер поражений изучают на тёмном фоне.
Животные модели
При невозможности выделить и идентифицировать вирус стандартными методами in vitro инфекционный материал вводят чувствительным к возбудителю животным, и после развития типичного инфекционного процесса проводят повторное заражение чувствительных клеточных культур. Наиболее часто используют мышей, кроликов и обезьян; для выделения некоторых вирусов (например, вирусов Коксаки) заражают мышат-сосунков. Вследствие дороговизны и сложности содержания лабораторных животных, практически повсеместно их вытеснили клеточные культуры. Тем не менее, животные модели активно используют для изучения особенностей патогенеза и формирования иммунных реакций при вирусных инфекциях.
Идентификация вирусов
Качественное определение
Наличие и биологическую активность вирусов определяют по эффектам, наблюдаемым на животных моделях (повышение температуры тела, появление характерных клинических признаков, гибель и т.д.), куриных эмбрионах и на клетках (в культурах). Под воздействием конкретных вирусов возможно изменение морфологии, роста, репродукции клеток либо их разрушение. Факт размножения вирусов в чувствительных клетках in vitro определяют по цитопатическим эффектам (в том числе бляшкообразованию, тельцам включений), феномену гемадсорбции, «цветной реакции».
Цитопатические эффекты оценивают при микроскопии клеточных культур. По степени поражения клеток выделяют вирусы с высокой или умеренной цитопатогенностью. Размножение вирусов в культурах клеток сопровождается нарушениями морфологии клеток монослоя. Некоторые вирусы вызывают характерные цитопатические изменения, что (с учётом клинической картины заболевания) позволяет быстро поставить предварительный диагноз. Например, размножение парамиксовирусов (вирусы кори, паротита, PC-вирус) сопровождается появлением характерных гигантских многоядерных клеток; аденовирусы вызывают образование скоплений больших круглых клеток, а при репродукции герпесвирусов клетки округлой формы диффузно располагаются по всему монослою.
Бляшкообразование. «Бляшками» называют негативные колонии - участки разрушенных клеток, выглядящие как зоны просветления на монослоях клеток, покрытых слоем агара. В некоторых случаях дозу и цитопатогенность вируса выражают в бляшкообразующих единицах (БОЕ).
Тельца включений. Многие вирусы вызывают появление в заражённых клетках характерных образований - скоплений вирусных белков или частиц, видимых в световой микроскоп. Тельца включений могут располагаться как в цитоплазме (тельца Гварнери при оспе), так и в ядрах клеток (аденовирусы).
Отсутствие цитопатического эффекта. Некоторые вирусы (например, вирус краснухи) не проявляют цитопатического эффекта. Их можно выявлять по интерференции другого вируса, способного вызывать дегенерацию заражённых клеток.
Феномен гемадсорбции. Многие заражённые вирусами клетки приобретают способность сорбировать на своей поверхности различные эритроциты. Феномен гемадсорбции имеет общие механизмы с гемагглютинацией и проявляется на ранних сроках, до проявления цитопатического эффекта, при его отсутствии либо слабой выраженности.
«Цветная реакция». В культуральную среду, используемую для поддержания клеток, вносят индикатор. Рост клеток сопровождается накоплением метаболитов, сдвигом рН среды и изменением окраски индикатора. Заражение культур вирусом резко ингибирует клеточный метаболизм, и среда сохраняет первоначальный цвет.
Экспресс-диагностика. Для быстрой идентификации вирусной инфекции разработаны многочисленные методы экспресс-диагностики, основанные на обнаружении вирусных Аг. Например, для ранней диагностики ВИЧ-инфекции широко используют ИФА, выявляющий поверхностные Ar вируса.
Количественное определение
Количественное определение вирусов проводят двумя путями - изучением инфекционности и количественным определением вирусных Аг. Определение титра инфекционности вирусов в значительной степени зависит от метода количественного исследования; у бактериофагов отношение инфекционность-частица составляет приблизительно 1 (то есть каждая вирусная частица способна вызвать инфекцию), для вирусов животных данное отношение составляет 1:10 (иногда выше из-за вирусингибирующего действия факторов резистентности).
Определение инфекционности вирусов. Наиболее доступная форма количественного определения - подсчёт числа вирусных «бляшек». Прямые тесты на инфекционность применяют для установления инфекционной дозы (ID) или летальной дозы (LD) изучаемого вируса (обычно выражают в lg). ID 50 - разведение, инфицирующее 50% клеток; LD 50 - разведение, убивающее 50% поражённых клеток или животных.
Выявление вирусных Аг и вирусных частиц. Наиболее распространённый метод - реакция количественной гемагглютинации. Метод основан на способности вирусов сорбироваться на поверхности эритроцитов животных и человека. Количественную электронную микроскопию применяют для подсчёта общего числа вирусных (но не инфекционных) частиц в исследуемом обьекте (например, культуральной жидкости).
Морфология вирусов
Изучение морфологии вирусов возможно лишь при помощи электронной микроскопии, однако чаще всего этот метод недоступен из-за отсутствия столь дорогого и сложного прибора. Более того, многие возбудители морфологически сходны, что снижает ценность этого метода. Наиболее распространён метод микроскопии содержимого везикул и тканевых экстрактов, обработанных красителями (негативное контрастирование), с последующим подсчётом ДНК- или РHK-содержащих вирусов. Электронная микроскопия позволяет быстро обнаружить орто- и парамиксовирусы в отделяемом дыхательных путей, герпесвирусы в жидкости везикул и ротавирусы в фекалиях.
Серологические методы идентификации
При большинстве вирусных инфекций развиваются иммунные реакции, применяемые для диагностики. Клеточные реакции обычно оценивают в тестах цитотоксичности лимфоцитов в отношении инфекционных агентов или заражённых ими клеток-мишеней либо определяют способность лимфоцитов отвечать на различные Аг и митогены. В работе практических лабораторий выраженность клеточных реакций определяют редко. Большее распространение нашли методы идентификации противовирусных AT.
РН основана на подавлении цитопатогенного эффекта после смешивания вируса со специфичными AT. Неизвестный вирус смешивают с известными коммерческими антисыворотками и после соответствующей инкубации вносят в монослой клеток. Отсутствие гибели клеток указывает на несоответствие инфекционного агента и известных AT.
Торможение гемагглютинации. РТГА применяют для идентификации вирусов, способных агглютинировать различные эритроциты. Для этого смешивают культуральную среду, содержащую возбудитель, с известной коммерческой антисывороткой и вносят в культуру клеток. После инкубации определяют способность культуры к гемагглютинации и при её отсутствии делают заключение о несоответствии вируса антисыворотке.
Торможение цитопатического эффекта интерференцией вирусов. Реакцию торможения цитопатического эффекта за счёт интерференции вирусов применяют для идентификации возбудителя, интерферирующего с известным цитопатогенным вирусом в культуре чувствительных клеток. Для этого в культуральную среду, содержащую изучаемый вирус, вносят коммерческую сыворотку (например, к вирусу краснухи при подозрении на неё), инкубируют и заражают вторую культуру; через 1-2 дня в неё вносят известный цитопатогенный вирус (например, любой ЕСНО-вирус). При наличии цитопатогенного эффекта делают вывод о том, что первая культура была заражена вирусом, соответствовавшим применённым AT.
Прямая иммунофлюоресценция. Среди прочих тестов наибольшее распространение нашла реакция прямой иммунофлюоресценции (наиболее быстрая, чувствительная и воспроизводимая). Например, идентификация ЦМВ по цитопатогенному эффекту требует не менее 2-3 нед, а при использовании меченых моноклональных AT идентификация возможна уже через 24 ч. Имея набор подобных реагентов, их можно вносить в культуры, заражённые вирусом, инкубировать, отмывать не связавшийся реагент и исследовать с помощью люминесцентной микроскопии (позволяет выявить наличие флюоресценции заражённых клеток).
Иммуноэлектронная микроскопия (аналог предыдущего метода) позволяет идентифицировать различные виды вирусов, выявленные электронной микроскопией (например, различные виды герпесвирусов), что невозможно сделать, основываясь на морфологических особенностях. Вместо антисывороток для идентификации используют помеченные разными способами AT, но сложность и дороговизна метода ограничивают его применение.
Выявление противовирусных AT в сыворотке
Более простой и доступный подход - выявление противовирусных AT в сыворотке. Образцы крови необходимо отбирать дважды: немедленно после появления клинических признаков и через 2-3 нед. Чрезвычайно важно исследовать именно два образца сыворотки. Результаты однократного исследования нельзя считать окончательными из-за невозможности связать появление AT с настоящим случаем. Вполне возможно, что эти AT циркулируют после предшествующей инфекции. В подобной ситуации роль исследования сыворотки, полученной в период реконвалесценции, трудно переоценить. На наличие заболевания в период отбора первой пробы указывает не менее чем четырёхкратное увеличение титра AT, выявленное при исследовании второй пробы.
Перечисленные ниже методы не позволяют дифференцировать AT, образующиеся во время болезни и циркулирующие после выздоровления (продолжительность этого периода вариабельна для различных инфекций). Поскольку для адекватной диагностики необходимо подтвердить достоверное увеличение титров AT в двух пробах, то первую пробу исследуют в острой фазе, а вторую - в период выздоровления (через 2-3 нед). Полученные результаты носят ретрос пективный характер и более пригодны для проведения эпидемиологических обследований.
РТГА выявляет AT, синтезируемые против гемагглютининов вирусов (например, вируса гриппа). Метод позволяет легко выявлять подобные AT в сыворотке больного.
РСК - основной метод серодиагностики вирусных инфекций (среди доступных). Реакция выявляет комплементсвязывающие IgM и IgG, но не дифференцирует их; для оптимизации получаемых результатов постановка реакции требует определённых навыков персонала.
РИФ. При возможности получить биоптат инфицированной ткани и доступности коммерческих наборов AT, меченных флюоресцеином, диагноз может подтвердить реакция прямой иммунофлюоресценции. Постановка реакции включает инкубацию исследуемой ткани с AT, их последующее удаление и люминесцентную микроскопию образца.
Иммуносорбционные методы (например, ИФА и РИА) более информативны, поскольку выявляют IgM и IgG по отдельности, что позволяет делать определённые выводы о динамике инфекционного процесса или состоянии реконвалесценции. Для выявления AT известный Аг сорбируют на твёрдом субстрате (например, на стенках пробирок, пластиковых микропланшетах, чашках Петри) и вносят различные разведения сыворотки пациента. После соответствующей инкубации не связавшиеся AT удаляют, вносят антисыворотку к lg человека, меченную ферментом, повторяют процедуру инкубирования и отмывания несвязанных AT и вносят какой-либо хромогенный субстрат (чувствительный к действию фермента). Поскольку изменение окраски пропорционально содержанию специфических AT, то вполне возможно определение их титра спектрофотометрическим способом. В диагностике ВИЧ-инфекции наибольшее распространение нашёл метод иммуноблотинга.
Выявление вирусных Аг
ИФА. В настоящее время уже появились коммерческие наборы для выявления Аг некоторых возбудителей, позволяющие их идентифицировать в течение 5-10 мин. Для выявления Аг на твёрдой фазе сорбируют известные AT и добавляют сыворотку, содержащую Аг; после инкубирования несвязанный Аг декантируют, систему промывают и вносят меченые AT, специфичные к сорбированным AT. Повторяют процедуру инкубирования и отмывания, вносят хромогенный субстрат, положительный результат фиксируют при изменении окраски системы.
Гибридизация ДНК - высокоспецифичный метод, позволяющий идентифицировать геном вируса после его гибридизации комплементарными молекулами ДНК. В качестве маркёра применяют ферменты и изотопы. Метод определяет способность вирусной ДНК гибридизироваться с меченой комплементарной ДНК; специфичность метода прямо пропорциональна длине I комплементарной цепочки. Перспективен метод гибридизации нуклеиновых кислот in situ. Для постановки реакции меченую ДНК наносят на биоптаты тканей (в том числе на фиксированные формалином или заключённые в парафиновые блоки) и регистрируют взаимодействие с комплементарной ДНК. Метод используют для выявления вирусов простого герпеса, папилломы человека, Эпстайна-Барр и др.
ПЦР. Метод значительно увеличивает чувствительность метода гибридизации, повышая содержание вирусной ДНК в материале, полученном от больного, а также ускоряет время получения результата.
